المحاضرة 14 : تحاليل بتقنية الكروماتوجراف Chromatgraphy

ان تقنية الكروماتوجرافى Chromatography تستخدم في عمل الكثير من التحاليل وهي من الطرق الشائعة في المعامل لذلك سوف نتعرف على الفكرة من اجراء التحليل وانواع التحاليل الخاصة بها

الفكرة من عمل تقنية الكروماتوجراف 

تقنيه الكروت تعتمد على مبدأ flow immunochromatography وهذه التقنية تجمع بين خاصيه
antibody antigen interaction و خاصيه lateral flow فى ورق الكروماتوجرافي

التقنيه الخاصة بكارت الحمل تسمى ( One step noncompetitive immunochromatographic assay )


يحتوى الكارت على 5 مناطق رئيسيه

- الاولي sample pad  و هو الجزء من الكارت الذي يوضع فيه العينة

- الثانيه conjugate pad  و هو عباره عن اجسام مضاده للماده التى نبحث عنها 

- الثالثه test line و  تحتوى على اجسام مضاده ايضا للماده التى نبحث عنها لكن بالطبع مختلفه عن الاولي 

- الرابعه  control line و تحتوى على اجسام مضاده تسمى Anti-antibodyو هى متخصصه فى انها ترتبط ب human antibodies 

- الخامسه absorbing pad  و هو الجزء الاخير من الشريط حيث يقوم بسحب العينه و المكونات الاخري على الشريط لضمان وصولهم لنهايه الشريط

1 - تحليل الحمل Pregnancy test Qualitative

 تحدث عملية التلقيح عادة بوجود البويضة وقت الاباضة او خلال 24 ساعة من حدوث الاباضة حيث تستطيع الحيوانات المنوية العيش لمده تصل من 3 – 5 ايام ويتم تلقيح البويضه في الثلث الاول من قناة فالوب ثم تبقي هناك من 3 – 4 ايام وهي تنقسم حتى تصل الي مرحلة morula stage حيث يكون عدد الخلايا بيها من 8 – 32 خلية ثم تبدأ بالتحرك ناحية الرحم وتسبح ببطئ حتى تصل بعد 72 ساعة وفي اليوم السادس تبدا بالانغراس في جدار الرحم لتكون اول رابط بين البويضه (الجنين) وجدار الرحم وتسمى بعملية التعشيش implantation ويتم افراز هرمون human chorionic gonadotropin وهذا هو هرمون الحمل الذي يظهر في التحليل وعادة ما يظهر في تحليل الدم اولا قبل البول حيث يحاول اختبارالحمل تحديد ما إذا كانت المرأة حامل أم لا عن طريق الكشف عن هرمون HCG

طريقة اجراء التحليل 

هو إما شريط أوكارت مشبع مع الجلوبيولين مضاد HCG ويمكن عمله في الدم او البول 

اختبارالحمل في البول Urine pregnancy test يتم ذلك من 5 إلى 7 أيام بعد فترةالحيض المتأخرة

تفضل عينة بول صباح اليوم الأول لانها تكون اكثر تركيزا حتى تعطي نتائج اختبار دقيقة.

اختبارحمل الدم Blood pregnancy test

يتم ذلك من 3 إلى 4 أيام بعد فترة الحيض المتأخرة ويمكن الكشف عن هرمون الحمل في الدم من قبل ظهوره في البول.

 اختبارالدم يمكن أن يؤكد الحمل بعد 6 أيام من زرع البويضة المخصبة في الرحم.

1 - شريط الاختبار srtip test

مكون من خطين هما test وcontrol عند ظهور خط control فقط اذا لا يوجد حمل اما عند ظهور خط test مع control اذا يوجد حمل 









2 - الكارت Card device

ضع عدة قطرات من السيرم في منطقة الاختبار ومراقبة الخط الذي يظهر

هنا  الهرمون فى العينه سيرتبط بالاجسام المضاده الاولي مكونه ما يسمي  antibody conjugate/HCG complex وسوف يتحرك فى الشريط باتجاه test line  و هنا يحصل ان الاجسام المضاده الثانيه المثبته على هذا الخط تمسك فى  complex ده فتترسب  gold colloid  بجوار بعضها و يظهر خط احمر واضح مكان ال  test و يستمر سريان  complex  الذي لم يرتبط ب test و كذلك باقي  antibody conjugate  الى اخر الشريط فيقابل Anti-antibody فيترسب الاجسام المضاده المرتبطه بالماركر على خط الكنترول فيظهر خط احمر و بالتالي فى كل الاحوال سواء العينه محتويه على الهرمون او لا لابد ان يظهر خط الكنترول الناتج من ارتباط ال monoclonal antibody -gold colloid مع ال Anti-antibody و اذا لم يظهر هذا الخط يعنى ان لم يحدث flow من الاساس و الكارت لا بد ان يستبدل .

اسباب النتيجة الكاذبة السلبية  False Negative 

1- محاولة الكشف المبكر Early Detection Attempt

قد يكون أحد أسباب اختبارالحمل السلبي الخاطئ هوان الاختبار مبكرًاجدًا اي أن ممكن البويضة قد يتم تخصيبها وهذا يعني أنك قد يكون هناك حمل، ولكن لم يبدأ الجسم في إفرازما يكفي من هرمون الحمل .

2 -  استخدام البول المخفف Using diluted urine

من الممكن شرب الكثيرمن الماء قبل عمل الاختبار يؤثرعلى دقة الاختبار.

اسباب النتيجة الكاذبة الايجابية False Positive 

1 - اختبارغيرصحيح Improper testing

بعض الاختبارات سوف تنتج نتيجة اختبارإيجابية كاذبة إذا تمت قرائتها بعد الوقت المطلوب وبالتالي يجب استعمال stop watch عند قرائة النتيجة كما هو مذكور في البامفلت

2 - تدخل اختبار Test interference

يجب على النساء اللاتي يتلقين العلاج بـ hCG لعلاج مشكلة خصوبة استشارة الطبيب عند إجراء الاختبار لأنه من الممكن أن يكون إيجابيًا اختبار البول أو الدم لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع بعد العلاج وعدم الحمل.

3 - الظروف الطبية Medical conditions

أشكال معينة من السرطان،مثل choriocarcinoma نوع نادر للغاية من السرطان يمكن أن يسبب ارتفاع في مستوى هرمون الحمل وكذلك أنواع معينة من سرطان الثدي،أوسرطان المبيض يؤدي إلى نتيجة إيجابية كاذبة


ملحوظة 1 :-

• حساسية اختبارالحمل 25 mIU/ml

ملحوظة 2 :-

في حالة ظهور خط ضعيف فى اختبار الحمل  يجب التأكد بعمل اختبار حمل رقمي  HCG 

وفي حالة ظهورخط ضعيف فى اختبار فيروس سي  يجب التأكد بتقنية ELISA 

في حالة ظهور خط خفيف في الكروت بكل انواعها بعد 10 الى 15 دقيقه على الاكثر يسمى evaporation line  drying بسبب جفاف الكارت على العكس تماما فى طريقة competitive immuno-chromatographic assays  مثل كارت المخدرات  toxicology screen اي خط خفيف مكان test تفسر النتيجه كنتيجه سلبيه مهما كان الخط ضعيف
النتائج الايجابيه تستلزم عدم وجود اي خط نهائي test .

2 - تحاليل الفيروسات  Qualitative

حيث يتم الكشف عن فيروس سي و بي وايضا فيروس الايدز 

 * الكشف عن فيرس سي HCV 

اختبار C Card anti-HCV السريع هواختبار نوعي بسيط وبصري سيكشف عن الأجسام المضادة في السيرم 

 هذا الاختبار يمكن أن يعطي نتيجة في غضون 15 دقيقة ويستندعلىimmunochromatography.

 يستخدم هذا الاختبارللكشف النوعي للأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبدالوبائي (HCV) وهواختبارسريع لمكافحةHCV.

 في حالة ظهورخط واحد (الكنترول) اذا النتيجة سلبية

 في حالة ظهو رخطان (الكنترول والاختبار) اذا النتيجة ايجابية 

نلاحظ هنا استخدام Buffer وهى نفس طريقة عمل تحليل Hiv

*  الكشف عن فيروس بي HBS

نفس طريقة عمل فيرس سي لكن لا نستخدم هنا Buffer

 لانستخدم buffer في حاله HBsAg لان الكميه المضافه كمية كبيرة  لاننا نبحث عن Surface Antigen وكميته في Serum المريض قليلة ف محتاجين اضافة كمية اكبر 

 في حالة  HCV و HIV نبحث عن Antibodies في سيرم المريض وAntigen موجود على الكارت  بكميه محدودة لذلك الكميه المطلوبه هي كميه صغيرة لتتناسب مع Antigen و في حال قمنا باضافه كمية كبيرة من السيرم ندخل في نظريه تأثير البروزون وهي ان كميه الاجسام المضاده اكبر من كميه الانتيجين فيتم الصراع مابين الاجسام المضاده اي منهم يمسك بالانتيجين وفي الواقع لا احد يمسكه ويَطلع False negative فعند اضافه الكميه المحدده من السيرم نقوم بإضافه ال buffer ليعمل Dilution للسيرم وبنفس الوقت يعمل ترحيل للعينه 

3 - تحاليل المخدرات Multi Drugs

توجد انواع كثيرة من المواد المخدرة المتعارف عليها ومن اشهرها 5 مجموعات

1- مجموعة opiates وتشمل (هيرويين/مورفين/كوكايين)

2- مجموعة amphetamines (المواد المنشطة)

3- مجموعة barbiturates (المواد المنومة)

4- مجموعة benzodiazepines (المواد المهدئة)

5- مجموعة cannabinoid (الحشيش/ابانجو/الماريجوانا)

 مدة بقاء المادة الفعالة داخل الجسم

تعتمد مدة بقاءالمادة الفعالة للمخدر داخل الجسم علي عدة عوامل اهمها :-

- الحالة الصحية العامة للشخص وسنه وخاصة حالة الكبد والكلى

- نوع المخدروهل المتعاطي مدمن او يتعاطى لاول مره او يستعمل المخدر بصوة غير مستمرة .

الحشيش والبانجو والماريجوانا تستمر المادة الفعاله في جسم المتعاطى لاول مره من يومين ال 3 ايام (يمكن ظهورها ايضا بعد 5 ايام)

اما في حالة المتعاطى اليومى والمعتاد فتستمر عادة لمدة اسبوعين ولكن يمكن احيانا ظهوره بعد مدة اطول تصل الي 6 اسابيع مع بعض الاجهزة الحساسة.

الافيون تستمر المادة الفعاله في جسم الانسان في حالة التعاطي لاول مرة من يوم الي يومين اما في حالة الادمان تستمر لمدة اسبوع .

هناك اجهزة متخصصه لهذه التحاليل وايضا يوجد كارت التحليل الفورى

ملحوظة3 :-

تعاطى كميات كبيرة من المياة قبل التحليل تخفف عينة البول ويمكن ان تقلل المدة التى يظهر بها المخدر .


الكارت هو عبارة عن جزئين الجزء العلوى به خمسة صفوف لاختبار المنشطات بالبول او عمود لمادة معينة وينتهى كل عمود باجزاء دورها تتشرب عينة البول وتجعلها تهاجر في الفلتر الخاص بذلك والجزء السفلى فهو عبارة عن تجويف يتم وضع عينة البول به .

التقنيه هذه  المره تتعامل مع انتيجين حجمه صغير  Drug  صعب تجهز له نوعين مختلفين من الاجسام المضادة فنلجأ ل  One step competitive immunochromatographic assay 

هنا المواقع على الكارت تحتوى على الاتى :

الاولي sample pad  و هذا  الجزء من الكارت  بيكون فيه عينه البول

الثانيهconjugate pad  وهو عباره عن اجسام مضاده للماده التى نبحث عنها 

الثالثه test line والتى تحتوى علي الانتيجن  Drug 

الرابعهcontrol line  و محتويه على اجسام مضادهAnti-antibody  وهى متخصصه فى انها تمسك فىhuman antibodies 

مثلا اذا افترضنا ان العينة تحتوى على ترامادول يحدث الاتي 

 الترامادول فى العينه سيتحرك فى الشريط و يتحد مع Tramadol-antibody- gold conjugate مكونا complex يتحرك هذا  complex حتى يصل  test line  المثبت عليه الترامادول بنفسه و لان ترامادول العينه شغل كل اماكن الانتيبودى فلن يرتبط ب test line و لن يظهر اى خط و يستمر سريان  complex الذي لم يرتبط ب test الى اخر الشريط فيقابل  Anti-antibody  فيترسب الاجسام المضاده المرتبطه بالماركر على خط الكنترول فيظهر خط احمر

اذن لو ظهر خط واحد فقط لان فى ترامادول فى العينه بمعنى ان ظهور خط واحد يقول ان النتيجه ايجابيه 

بينما لو افترضنا عدم وجود الترامادول كان ال Tramadol-antibody- gold conjugate  لم يجد شيئا فى العينه يتحد بيه و لما يصل الى خط ال  test  كان سيتحد مع الترامادول المثبت عليه و يعطى خط احمر و يستمر سريان المتبقي منه الى اخر الشريط ايضا مكونا خط احمر عند الكنترو ل و بذلك فان ظهور خطين عند ال  test  و ال control يقول ان النتيجه سلبيه 

طريقة التحليل

يتم وضع جزء بسيط من البول في الجزء المجوف من الكارت ونقوم بالانتظار من 10 ل 15 دقيقة حتى تتم عملية التشرب ..

 في حالة ظهور خط واحد (الكنترول) اذا النتيجة موجبة

في حالة ظهور خطان (الكنترول والاختبار) اذا النتيجة سلبية










ملحوظة 4 : 

يمكن الكشف عن  الدم المختبئ في البراز OCCULT BLOOD والميكروب الحلزونى H PYLORI بطريقة الكروت

تم شرح تفاصيل اكثر وطريقة العملى في هذا الفيديو